La culture cellulaire est l'un des outils les plus importants utilisés en biologie cellulaire et moléculaire, fournissant un excellent système modèle pour étudier la physiologie et la biochimie normales (par exemple, les études métaboliques, le vieillissement), les effets des médicaments et des composés toxiques sur les cellules ainsi que les effets de la mutagenèse cellulaire et de la carcinogenèse. Il est également utilisé dans le criblage et le développement de médicaments et dans la production à grande échelle de composés biologiques (par exemple vaccins, protéines thérapeutiques). Un avantage majeur de l'utilisation de la culture cellulaire pour l'une de ces applications est la cohérence et la reproductibilité des résultats qui peuvent être obtenus en utilisant un lot de cellules clonales.
culture de cellules
La culture cellulaire fait référence au prélèvement de cellules d'animaux ou de plantes et à leur croissance dans un environnement artificiel favorable. Les cellules peuvent être prélevées directement du tissu et dissociées par voie enzymatique ou mécanique avant la culture, ou elles peuvent provenir de lignées ou de souches cellulaires établies
1. Formation primaire
La culture primaire fait référence au stade de la culture après que les cellules ont été isolées du tissu et propagées dans des conditions appropriées jusqu'à ce qu'elles occupent tout le substrat disponible (c'est-à-dire qu'elles atteignent la confluence). À ce stade, les cellules doivent être sous-cultivées (c'est-à-dire passées) en les transférant dans un nouveau récipient avec un milieu de croissance frais pour fournir plus de place pour une croissance continue.
2. Lignées cellulaires
Après la première sous-culture, les cultures primaires sont appelées lignées cellulaires ou sous-clones. Les lignées cellulaires dérivées de cultures primaires ont une durée de vie finie (c'est-à-dire qu'elles sont finies) et lorsqu'elles sont repiquées, les cellules ayant le potentiel de croissance le plus élevé prédominent, ce qui entraîne un degré d'uniformité génotypique et phénotypique dans le sexe de la population.
3. Lignées cellulaires
Une lignée cellulaire devient une souche cellulaire si une sous-population de la lignée cellulaire est activement sélectionnée à partir d'une culture par clonage ou par d'autres méthodes. Les lignées cellulaires acquièrent souvent des modifications génétiques supplémentaires après l'initiation de la lignée parentale.
4. Lignées cellulaires limitées et lignées cellulaires continues
Les cellules normales ne se divisent généralement qu'un nombre limité de fois avant de perdre leur capacité à proliférer, un événement génétiquement déterminé appelé sénescence ; ces lignées cellulaires sont dites finies. Cependant, certaines lignées cellulaires deviennent immortelles par un processus appelé transformation, qui peut se produire spontanément ou être induit chimiquement ou viralement. Une lignée cellulaire finie devient une lignée cellulaire continue lorsqu'elle subit une transformation et acquiert la capacité de se diviser indéfiniment.
Les lignées cellulaires cultivées en continu sont sujettes à la dérive génétique, les lignées cellulaires finies sont vouées à vieillir, toutes les cultures cellulaires sont sensibles à la contamination microbienne et des pannes d'équipement peuvent survenir même dans les laboratoires les mieux gérés. Étant donné que les lignées cellulaires établies sont une ressource précieuse dont le remplacement est coûteux et prend du temps, il est essentiel de les cryoconserver pour un stockage à long terme.
Une fois qu'un petit nombre de cellules restantes sont obtenues à partir de la sous-culture, elles doivent être congelées en tant que stock de semence et protégées de l'utilisation générale en laboratoire. Les stocks de travail peuvent être préparés et réapprovisionnés à partir de stocks de semences congelées. Si le stock de semences est épuisé, le stock de travail cryoconservé peut être utilisé comme source pour préparer le stock de semences fraîches, ce qui donne une augmentation minimale de la quantité par rapport au gel initial.
La meilleure façon de cryoconserver les cellules cultivées est dans l'azote liquide, en milieu complet, en présence de cryoprotecteurs tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le glycérol. Les cryoprotecteurs abaissent le point de congélation du milieu et réduisent également la vitesse de refroidissement, réduisant considérablement le risque de formation de cristaux de glace, qui peuvent endommager les cellules et entraîner la mort cellulaire.
Le DMSO est connu pour faciliter l'entrée de molécules organiques dans les tissus. Lors de la manipulation de réactifs contenant du diméthylsulfoxyde, un équipement et des pratiques adaptés aux dangers de ce matériau doivent être utilisés. Éliminer les réactifs conformément aux réglementations locales.
Cultiver des cellules à partir de stocks de cellules de travail congelées
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Déterminer le nombre de passages, par exemple si les cellules précédentes ont été congelées et qu'elles ont été décongelées trois fois, le processus de décongélation serait le quatrième passage.
Ajouter un milieu de croissance (milieu minimal, sérum de veau et antibiotiques) aux flacons T75 étiquetés avec la lignée cellulaire, le numéro de passage et la date
Placer le ballon horizontalement dans un incubateur à CO à 37 degrés et 5 % de CO pendant au moins 15 min. Cela réchauffera le milieu et l'amènera à son pH normal (7.0-7.6)
Décongeler les flacons congelés avec des lignées cellulaires dans un bain-marie à 37 degrés sous agitation douce. Pour réduire le risque de contamination, maintenez le joint torique et le capuchon au-dessus du niveau de l'eau (2-5 minutes).
Placer le flacon dans une enceinte de sécurité biologique (BSL-2). Pour éviter toute contamination, essuyez avec de l'éthanol à 70 % avant d'ouvrir le flacon.
Transférer le contenu du flacon de cellules congelées dans un flacon T75 contenant un milieu de croissance. Mélanger et agiter doucement le flacon pour répartir uniformément les cellules sur la surface du flacon.
Incuber le flacon pendant la nuit dans un incubateur à CO2 à 37 degrés avec 5 % de CO2. Laisser les cellules se fixer pendant la nuit
changement de milieu de croissance
Incuber le flacon pendant 2-4 jours supplémentaires à 37 degrés, 5 % de CO2 et surveiller jusqu'à ce que les cellules se développent
Une fois que les cellules atteignent environ 90 % de confluence, le stock de cellules peut être étendu à l'aide d'un flacon T150