Lorsque vous venez d'obtenir votre diplôme et que vous êtes entré en fonction, vous êtes confronté à un tas de noms confrontés à des expériences de PCR quantitative en temps réel. Vous ne savez pas par où commencer ? Quelle est la signification de la courbe d'amplification, de la courbe standard, du seuil, de la valeur CT, de la courbe de fusion et de la ligne de base ? Les images fluorescentes de ces expériences sont trop lumineuses, mais je n'arrive pas à les identifier. Aujourd'hui, nous vous amènerons à apprendre ces connaissances et ces concepts en deux parties : les termes techniques et la foire aux questions.
Partie I Termes professionnels
1. Courbe d'amplification
La courbe d'amplification fait référence à la courbe où le numéro de cycle est l'abscisse et l'intensité de fluorescence en temps réel pendant la réaction est l'ordonnée pendant la PCR.
2. Base de référence
La ligne de base fait référence à peu de changement dans le signal fluorescent au cours des premiers cycles d'une réaction d'amplification par PCR. Le niveau du signal est proche d'une ligne droite, qui est la ligne de base.
3. Réglage du seuil de fluorescence
En règle générale, le signal de fluorescence des 15 premiers cycles de la réaction PCR est utilisé comme signal de fond de fluorescence, et le seuil de fluorescence est 10 fois l'écart type du signal de fluorescence pendant 3-15 cycles de PCR, et le seuil de fluorescence est réglé pendant la phase exponentielle de l'amplification PCR. Typiquement, chaque instrument a son seuil de fluorescence avant utilisation.
4. Valeur CT
La valeur CT représente le nombre de cycles qui se produiront pour chaque tube de réaction PCR lorsque le signal fluorescent atteint le seuil défini. D'après la recherche, nous savons qu'il existe une relation linéaire entre la valeur CT de chaque modèle et le logarithme du nombre de copies de départ de ce modèle. Plus le nombre de copies initial est élevé, plus la valeur CT est petite et vice versa. En utilisant des normes avec des nombres de copies de départ connus, une courbe d'étalonnage peut être faite où l'abscisse représente le logarithme du nombre de copies de départ, tandis que l'ordonnée représente la valeur CT. Par conséquent, tant que la valeur CT de l'échantillon inconnu est obtenue, le nombre de copies initial de l'échantillon peut être calculé à partir de la courbe standard.
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Il existe plusieurs indicateurs pour juger si la courbe d'amplification est bonne ou non :
Réponse: Le point d'inflexion de la courbe est évident, en particulier la phase exponentielle de l'échantillon de fraction faible-lourde est évidente, le parallélisme global de la courbe d'amplification est très bon, la ligne de base est plate, il n'y a pas de phénomène de montée et l'amplification La courbe de l'échantillon de concentration en phase exponentielle de bas niveau est très bonne. évident.
B : La pente de la phase exponentielle de la courbe est directement proportionnelle au rendement d'amplification, plus la pente est grande, plus le rendement d'amplification est élevé.
C : La ligne de base standard est plate ou légèrement décroissante, sans tendance à la hausse apparente.
D : Le parallélisme des courbes d'amplification pour chaque tube est bon, indiquant que l'efficacité d'amplification de chaque tube de réaction est similaire.
5. Courbe de fusion
Lorsque le produit de PCR est chauffé, à mesure que la température augmente, le produit d'amplification double brin se dissocie progressivement, entraînant une diminution de l'intensité de fluorescence. Lorsqu'une certaine température est atteinte, une grande quantité de produit se sépare, entraînant une forte diminution de la fluorescence. L'utilisation de cette fonction avec différentes valeurs de TM pour différents produits de PCR diffère également dans la température à laquelle le signal fluorescent diminue rapidement, ce qui peut être un bon moyen d'identifier la spécificité de la PCR.
6. Courbe de fusion (utilisant la courbe logarithmique)
Le graphique de crête est formé par le logarithme de la courbe de fusion pour afficher plus intuitivement la situation des fragments de produit. Étant donné que la température de fusion est la valeur TM d'un fragment d'ADN, certains paramètres affectant la valeur TM d'un fragment d'ADN peuvent être déterminés, tels que la taille du fragment, la teneur en GC, etc. Généralement, selon notre principe de conception d'amorce, on dit généralement que la longueur du produit amplifié est de l'ordre de 80-300pb et que la température de fusion doit être comprise entre 80 degrés et 90 degrés.
R : S'il n'y a qu'un seul pic principal entre 80 degrés et 90 degrés, cela signifie que la PCR en temps réel est parfaite.
B : Si le pic principal apparaît entre 80 degrés et 90 degrés et que le pic d'impureté apparaît en dessous de 80 degrés, l'amorce-dimère est essentiellement considérée. C'est une bonne option à essayer de résoudre en augmentant la température de recuit.
C : Si le pic principal apparaît entre 80 degrés et 90 degrés et qu'un pic errant apparaît lorsque la température augmente, la contamination par l'ADN est essentiellement envisagée. Et l'ADN doit être retiré dans les premières étapes de l'expérience.
7. Ligne de courbe standard
Les étalons standard ont été dilués à différentes concentrations et utilisés comme matrices pour les réactions de PCR. La courbe standard est tracée avec le logarithme du nombre de copies standard en abscisse et la valeur CT mesurée en ordonnée. Lors de la quantification d'un échantillon inconnu, le nombre de copies de l'échantillon peut être obtenu à partir de la courbe standard basée sur la valeur CT de l'échantillon inconnu. Les courbes standard sont très importantes pour la quantification absolue.
La seconde partie. Problème commun
Q1 : Quelle est la différence entre la RT-PCR, la QPCR, la PCR en temps réel et la RT-PCR en temps réel ?
A1 : La RT-PCR est une PCR de transcription inverse, qui est une variante largement utilisée de la réaction en chaîne par polymérase. Dans la RT-PCR, le brin d'ARN est transcrit de manière inverse en ADN complémentaire, qui est ensuite utilisé comme matrice pour la PCR afin d'amplifier l'ADN par PCR.
La PCR en temps réel et la QPCR sont la même chose, les deux sont une PCR quantitative en temps réel, ce qui signifie qu'il y a un enregistrement en temps réel des données à chaque cycle pendant le processus de PCR. De cette façon, le nombre de modèles de démarrage peut être précisément analysé.
Bien que la PCR en temps réel et la PCR à transcription inverse semblent être abrégées en RT-PCR, la convention internationale est que la RT-PCR se réfère spécifiquement à la PCR à transcription inverse, tandis que la PCR en temps réel est souvent abrégée en qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - temps PCR).
La RT-PCR en temps réel (RT-QPCR) est un type de PCR de transcription inverse qui combine des techniques quantitatives fluorescentes : première transcription inverse à partir d'ARN pour obtenir de l'ADNc (RT), suivie d'une analyse quantitative utilisant la PCR en temps réel (QPCR).
Q2 : Pourquoi la longueur du fragment de produit amplifié de la PCR quantitative fluorescente est-elle contrôlée dans la plage de 80-300 pb ?
A2 : La longueur de chaque séquence de gène est différente, certaines d'entre elles font plusieurs Kb et des centaines de BP. Cependant, lorsque nous concevons l'amorce, nous n'avons besoin que d'exiger que la longueur du produit soit 80-300 bp, et trop court ou trop long ne convient pas à la détection quantitative par PCR.
Les fragments de produit sont trop courts pour être distingués des amorces-dimères. La longueur de l'amorce-dimère est d'environ 30-40pb, lorsqu'elle est inférieure à 80pb, il est difficile de distinguer s'il s'agit d'une amorce-dimère ou d'un produit. Si le fragment de produit est trop long, dépassant 300 pb, cela conduira facilement à une faible efficacité d'amplification et la quantité de gène ne pourra pas être détectée efficacement.
Par exemple, lorsque vous comptez le nombre de personnes dans une salle de classe, vous n'avez qu'à compter le nombre de bouches. Il en va de même pour les tests de gènes. Il suffit de détecter une certaine séquence d'un gène pour représenter la séquence entière. Il est facile de faire une erreur si vous comptez à la fois la bouche et le nez, les oreilles et les lunettes pour compter les gens.
Q3 : Quelle est la longueur optimale pour la conception de l'amorce ?
A3 : En règle générale, les longueurs d'amorce de l'ordre de 20-24bp sont bonnes. Bien sûr, nous devons faire attention à la valeur TM de l'amorce lors de la conception de l'amorce, car elle est liée à la température de recuit optimale. Après de nombreuses expériences, il a été prouvé que 60 degrés est une bonne valeur TM. Une température de recuit basse peut facilement conduire à une amplification non spécifique, tandis qu'une température de recuit élevée conduit généralement à une faible efficacité d'amplification, à un pic tardif de la courbe d'amplification et à une valeur CT retardée.
Question 4 : La quantité d'échantillons collectés affecte-t-elle les résultats expérimentaux ?
A4 : Non. Évidemment, plus il y a d'échantillons collectés, plus il y a d'ARN extrait, plus il y a d'ADNc et plus il y aura de fragments cibles. Pour une quantification absolue, il est nécessaire de calculer le nombre de copies du fragment cible, et la quantité d'échantillon collecté affectera définitivement les résultats expérimentaux. Par exemple, la détection du virus de l'hépatite C VHB dans le sang consiste à détecter la teneur en VHB dans une certaine quantité (1 ml) de sang.
Pour la quantification relative couramment utilisée dans la recherche scientifique, le nombre d'échantillons n'a rien à voir avec les résultats expérimentaux, car la quantification relative fait référence à la comparaison entre le gène cible et le gène de référence. Veuillez simplement les considérer comme des fragments en amont et en aval présents dans le même brin d'acide nucléique. Si la taille de l'échantillon est grande, les gènes de référence et cibles sont augmentés dans des proportions égales en même temps, ce qui n'affecte pas les résultats.
Q5 : L'efficacité de la transcriptase inverse affectera-t-elle les résultats expérimentaux ?
A5 : comme ci-dessus. Notez que nous voulons une efficacité RT plus élevée, mais nous préférons que l'enzyme RT soit relativement stable et obtienne des résultats uniformes. Ce sera un test des capacités optimisées des suites de transcription inverse des grandes entreprises.
Question 6 : L'efficacité de l'enzyme TAQ affecte-t-elle les résultats expérimentaux ?
A6 : L'efficacité de l'enzyme TAQ est relativement grande. En règle générale, les enzymes taq à démarrage à chaud sont nécessaires et sont relativement efficaces. Pour les kits quantitatifs de fluorescence commerciaux, chaque fabricant optimisera l'efficacité du meilleur état en fonction de ses propres produits proches de 100 %, si l'efficacité est trop faible, les résultats expérimentaux ne peuvent pas être obtenus. Pour les produits de différentes entreprises, il s'agit d'une mesure de qualité.
Question 7 : La quantité de colorant fluorescent affecte-t-elle les résultats expérimentaux ?
A7 : Oui, ce sera le cas. Si le fluorochrome est trop saturé, il peut provoquer des interférences sonores dans certains instruments. Si le fluorochrome n'est pas saturé et que la valeur de fluorescence est trop faible, il entrera tôt dans une phase de plateau et la courbe d'amplification sera plate. Dans l'expérience quantitative de fluorescence, la valeur CT est principalement visible, il n'est donc pas important que la courbe d'amplification tardive entre dans la phase de plateau, mais l'image n'est pas assez belle. Si vous deviez choisir, commencez par choisir un fluorochrome un peu moins saturé. Cependant, lors de l'utilisation du même produit de la même entreprise, son effet est fondamentalement négligeable.
Question 8 : La transmission du tube PCR affectera-t-elle les résultats expérimentaux ?
R8 : Oui. Cependant, pour un même lot de consommables d'un même fabricant, cet effet peut être ignoré. C'est un bon choix et il est préférable d'utiliser une plaque à puits 96- avec une membrane à haute perméabilité pour minimiser l'effet de la transmission de la lumière des consommables.
Q9 : Les erreurs pendant le fonctionnement affecteront-elles les résultats expérimentaux ?
A9: L'influence du processus de fonctionnement se reflète principalement dans l'uniformité. L'homogénéité signifie que tous les composants du système sont mélangés uniformément, et la centrifugation éclair peut résoudre ce problème. De plus, pour les débutants, il est préférable d'ajuster le système PCR à plus de 20 pouces, et un système trop petit est plus sujet aux erreurs. Si la température de recuit est optimisée correctement, l'effet de la concentration d'amorce sur CT est minimisé. Et vous saurez que certaines erreurs opérationnelles (telles que la concentration d'amorce) peuvent être évitées en optimisant la température de recuit.
Résumer
Ce qui précède sont quelques questions et questions que les novices rencontrent souvent au cours de l'expérience, nous espérons que ces questions pourront vous aider à résoudre certaines confusions. L'expérimentation est le processus de génération du chaos et de résolution de problèmes, j'espère que vous en tirerez quelque chose. Merci d'avoir lu et à la prochaine !
