Qu'est-ce que la culture cellulaire ?
culture de cellules
La culture cellulaire fait référence au processus de croissance de cellules dans des conditions contrôlées en dehors de leur environnement naturel. C'est un outil in vitro qui facilite la compréhension de la biologie cellulaire et des mécanismes de la maladie. Il joue également un rôle dans la découverte de médicaments, tels que les tests de toxicité des médicaments et les études pharmacocinétiques/pharmacodynamiques, ainsi que la médecine personnalisée.
L'embryologiste américain Ross Granville Harrison a développé les premières techniques de culture cellulaire in vitro au début du XXe siècle, lorsqu'il a réussi à cultiver in vitro des fragments de tissus d'embryons de grenouilles. Aujourd'hui, la culture cellulaire a contribué à d'innombrables découvertes, telles que le développement de vaccins contre la poliomyélite, la rougeole, les oreillons et d'autres maladies infectieuses.
Culture d'adhésion et de suspension
Il existe deux systèmes de base pour la croissance cellulaire : la culture adhérente et la culture en suspension. Les cultures adhérentes sont cultivées sur des substrats artificiels, tandis que les cellules des cultures en suspension flottent librement dans le milieu. Alors que seuls quelques types de cellules se développent naturellement en suspension (par exemple les lymphocytes), de nombreux types de cellules adhérentes peuvent être adaptés à la culture en suspension.
Il existe deux raisons de cultiver des cellules naturellement adhérentes en suspension. Le premier avantage de la culture en suspension est que les cellules sont plus faciles à passer car vous n'avez pas besoin de les dissocier enzymatiquement ou mécaniquement du récipient de culture. Deuxièmement, les cultures en suspension sont plus faciles à mettre à l'échelle car la croissance cellulaire n'est limitée que par leur concentration dans le milieu, et non par la surface disponible. Le principal inconvénient des cultures en suspension est qu'elles nécessitent des comptages cellulaires quotidiens et des tests de viabilité pour suivre les schémas de croissance, tandis que les cultures adhérentes peuvent être facilement examinées au microscope.
Méthodes 2D et 3D
Les cultures adhérentes peuvent être divisées en cultures 2D et 3D. Dans les applications 2D, les cellules adhérentes sont cultivées dans un système monocouche sur une surface plane, comme dans un flacon de culture cellulaire.
culture de cellules
En raison de sa simplicité, la technologie 2D ne peut pas imiter l'environnement in vivo des cellules, qui se développent généralement dans des structures tridimensionnelles avec des interactions complexes de cellule à cellule. C'est pourquoi certaines expériences sont réalisées à l'aide de cultures 3D qui peuvent être cultivées à l'aide de technologies à base d'échafaudage ou sans échafaudage.
Les méthodes 3D à base d'échafaudage impliquent généralement la croissance de cellules adhérentes dans des échafaudages d'hydrogel. Des alternatives telles que les échafaudages en biocéramique, en métal ou en polymère sont également utilisées pour certaines applications.
Des techniques sans échafaudage sont utilisées pour faire pousser des sphéroïdes par l'une des trois méthodes différentes :
Flotteur forcé : Chargez la suspension cellulaire dans les puits d'une microplaque enduite de polymère à faible adhérence. La microplaque est ensuite centrifugée pour forcer les cellules à former des sphéroïdes.
Goutte suspendue : La suspension cellulaire est chargée dans les puits d'une plaque de goutte suspendue. Comme son nom l'indique, la suspension s'accrochera à la plaque sous forme de gouttelettes. Les cellules s'agrègeront aux extrémités de ces gouttelettes et formeront des sphères.
Basé sur l'agitation : la suspension cellulaire est placée dans un bioréacteur rotatif. En raison de l'agitation constante, les cellules étaient incapables d'adhérer aux parois, formant ainsi des sphéroïdes.
Défi de la culture cellulaire
Malgré les différences de méthodes et de techniques, toutes les expériences ont un point commun : il est difficile de faire pousser des cellules vivantes en nombre suffisant pour obtenir des résultats reproductibles. Par conséquent, les sections suivantes seront consacrées à quatre défis - la répétabilité, la contamination, la faisabilité et la transition vers l'automatisation.
reproductibilité
Selon une enquête de Yongyue Medical, plus de 70 % des scientifiques ont déclaré qu'ils n'avaient pas réussi à reproduire les expériences d'un autre scientifique, et plus de la moitié n'avaient pas réussi à reproduire leur propre travail. Dans les tests de culture cellulaire, la plupart des problèmes de reproductibilité proviennent de différences biologiques entre les passages cellulaires ou les générations. Un autre gros problème est la mauvaise identification des lignées cellulaires, et les incohérences dans les paramètres de culture jouent également un rôle important.
variation biologique
Des facteurs tels que des mutations aléatoires ou des erreurs de transcription peuvent affecter la reproductibilité des expériences chaque fois qu'une cellule se divise. Pour éviter cela, vous devez créer une banque de cellules au début d'un nouveau projet.
banque de cellules
La banque de cellules fait référence au processus de stockage de lots de types de cellules spécifiques pour une utilisation ultérieure afin d'éviter des facteurs tels que des mutations aléatoires ou des erreurs de transcription qui affectent la reproductibilité. La première étape consiste à établir une banque de cellules maîtresses (MBC) en cultivant des types de cellules sélectionnés d'intérêt en culture et en les cryoconservant dans plusieurs conteneurs. Les lots de MBC sont décongelés et utilisés ultérieurement pour préparer des banques de cellules de travail (WBC).
Mauvaise identification des lignées cellulaires
Le problème de l'identification erronée des lignées cellulaires est connu depuis les années 1960, lorsqu'un scientifique a décrit la contamination par les cellules HeLa de 19 autres lignées cellulaires humaines. Pour vous assurer que vos résultats sont fiables et, plus important encore, que vous ne tirez pas de fausses conclusions, vous devez mettre en quarantaine toutes les nouvelles lignées cellulaires entrant dans le laboratoire jusqu'à ce que leur origine ait été vérifiée. Plus important encore, il est recommandé de répéter la qualification de la lignée cellulaire avant la cryoconservation et la distribution à d'autres laboratoires et une fois le projet terminé. Pour vérifier une lignée cellulaire, vous devez d'abord vérifier si elle est répertoriée dans le registre des lignées cellulaires mal identifiées. S'il n'est pas enregistré, vous devez encore confirmer son authenticité. Pour les lignées cellulaires humaines, une analyse à répétition en tandem courte (STR) (empreinte ADN) est recommandée. Diverses méthodes de test sont disponibles pour les lignées cellulaires non humaines, notamment le caryotypage, l'analyse des isoenzymes et le typage de l'ADN mitochondrial (codage à barres ADN).
Paramètres de culture
Un troisième facteur affectant la reproductibilité est les paramètres de culture.
Par exemple, les niveaux d'oxygène peuvent affecter de manière significative les cellules cultivées. Cependant, les variables qui affectent l'oxygénation, telles que la taille de la chambre ou la densité cellulaire, ne sont pas toujours documentées et ne peuvent donc pas être maintenues cohérentes.
Un autre paramètre de culture important est le milieu. Cela fournit des nutriments essentiels, des facteurs de croissance et des hormones, et régule le pH et la pression osmotique. Par conséquent, le plus important est que sa composition soit toujours la même. Ceci est particulièrement critique pour les formulations moyennes complétées par du sérum bovin fœtal (FBS), dont la composition dépend de facteurs tels que le régime alimentaire de la vache, l'emplacement géographique et la période de l'année. Pour minimiser l'effet du FBS sur la reproductibilité des résultats, vous devez commander différents lots de sérum lorsque les stocks actuels commencent à s'épuiser et les tester pour trouver la correspondance la plus proche. Pour que d'autres puissent reproduire vos résultats, vous devez indiquer comment vous avez analysé le sérum et enregistrer le numéro de lot.
culture de cellules
Traitement cellulaire
La plupart des chercheurs savent que les paramètres de culture ont un impact énorme sur leurs applications, mais les changements dans les techniques de traitement sont souvent négligés.
Pollution
Lorsque les cellules sont isolées des tissus et cultivées en laboratoire, elles ne sont plus protégées par le système immunitaire et sont donc extrêmement vulnérables à la contamination.
La première source de contamination est les contaminants abiotiques tels que les impuretés dans le milieu de culture, le sérum, les suppléments ou l'eau, ainsi que les endotoxines et les relargables. Les précautions comprennent l'utilisation d'eau de qualité laboratoire pour les expériences de culture cellulaire, ainsi que des milieux, du sérum, des suppléments et des consommables de fabricants qui offrent une certification de test d'endotoxines. De plus, les consommables doivent être fabriqués à partir de polystyrène ou de polypropylène vierge pour garantir que les additifs plastiques ne s'infiltrent pas dans votre culture cellulaire.
La deuxième source de contamination est constituée par les contaminants biologiques tels que les bactéries (y compris les mycoplasmes), les champignons et les levures.
faisabilité
La viabilité cellulaire est définie comme la proportion de cellules viables dans un échantillon. En plus des contaminants que nous venons de voir, il existe divers autres facteurs qui affectent la viabilité cellulaire. Les conditions environnementales (température, pH, pression osmotique, disponibilité des nutriments et concentrations d'O2 et de CO2) sont très importantes. La plupart de ces variables sont contrôlées par le milieu et sont spécifiques au type de cellule, ce qui signifie malheureusement que nous ne pouvons pas fournir de directives spécifiques.
Étant donné que les cellules sont très sensibles à la pression, vous devez faire attention non seulement aux conditions environnementales, mais également à vos techniques de manipulation des liquides.
Un dernier facteur affectant la viabilité cellulaire est la sénescence. La plupart des lignées cellulaires finies survivent 20 à 60 divisions avant de mourir, ce qui signifie qu'elles ne peuvent être réutilisées qu'entre 15 et 45 générations. Ensuite, l'échantillon cryoconservé doit être décongelé de la banque de cellules. Les lignées cellulaires continues peuvent proliférer indéfiniment, mais comme elles sont sujettes à la dérive génétique, elles doivent être remplacées régulièrement.
Des tests de détection utilisant des méthodes colorimétriques, fluorométriques et bioluminescentes peuvent être utilisés pour mesurer la viabilité cellulaire. Une méthode colorimétrique couramment utilisée est la méthode MTT, qui est basée sur la réduction de sels de tétrazolium jaunes en cristaux de formazan violets par des cellules vivantes.
96-plaques à puits
automatisation
Bon nombre des défis décrits ci-dessus peuvent être résolus en automatisant les flux de travail de culture cellulaire. Par exemple, la manipulation des cellules sera toujours cohérente, ce qui aura un impact positif sur la reproductibilité et la viabilité. Plus important encore, l'automatisation réduit le risque de contamination des utilisateurs.
Malgré ces avantages, l'automatisation de flux de travail entiers peut être difficile pour des raisons budgétaires, le manque d'espace pour les robots ou le manque de ressources pour automatiser et valider chaque étape à la fois. Mais cela peut être résolu!