La technologie PCR doit avoir synthétisé artificiellement des amorces raisonnables et extrait l'ADN de l'échantillon, puis effectuer un cycle thermique automatique, et enfin effectuer l'identification et l'analyse du produit. À l'heure actuelle, la conception et la synthèse des amorces ne peuvent être effectuées que dans quelques instituts de recherche, instituts et cliniques dotés d'une forte puissance technique. L'application n'a besoin que d'acheter le kit de détection PCR pour commencer le travail. Il existe de nombreux facteurs d'influence dans le cycle thermique automatique PCR. Pour différents échantillons d'ADN, la quantité de divers composants ajoutés dans la réaction PCR et les paramètres du cycle de température sont incohérents.
Plusieurs principaux facteurs d'influence sont maintenant présentés comme suit.
Un, paramètres de cycle de température
Dans le cycle thermique automatique PCR, le facteur le plus critique est la température de dénaturation et de recuit. Comme le montre l'exemple d'opération, les conditions de dénaturation, d'annelage et d'extension sont : 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, un total de 25～30 A de cycle, le fragment amplifié est de 500 pb. Ici, le temps de chaque étape doit être calculé une fois que le mélange réactionnel a atteint la température requise. Dans le thermocycleur automatique, le temps écoulé entre la température d'origine du mélange et la température requise prend de 30 à 60 s. La durée de ce délai dépend de plusieurs facteurs, notamment le type de tube de réaction, l'épaisseur de paroi, le volume de mélange réactionnel, source (bain d'eau ou bloc chauffant), et la différence de température entre les deux étapes, qui doit être adéquatement fournie lors du réglage du cycle thermique Faites attention et prenez en compte, et la mesure réelle doit être effectuée sur chaque instrument.
Une autre considération importante concernant le temps de cycle thermique est la distance entre les deux amorces ; plus la distance est grande, plus il faut de temps pour synthétiser toute la longueur de la séquence cible. Le temps de réaction donné ci-dessus est basé sur la longueur de synthèse optimale de 500 pb. La séquence cible est établie. Voici une introduction à la sélection de différentes températures.
1. Température de dénaturation du modèle La température de dénaturation détermine la température à laquelle l'ADN double brin fond dans la réaction PCR. Si la température de dénaturation n'est pas atteinte, aucune matrice d'ADN simple brin ne sera produite et la PCR ne démarrera pas. Une température de dénaturation basse signifie une dénaturation incomplète, l'ADN double brin se renaturera rapidement, réduisant ainsi le rendement. Généralement 90～95℃. Une fois que l'échantillon atteint cette température, il doit être rapidement refroidi à la température de recuit. La dénaturation de l'ADN ne prend que quelques secondes, et elle n'est pas nécessaire pendant longtemps ; au contraire, vous devriez faire de votre mieux à haute température. Raccourcissez-le pour maintenir l'activité de la Taq ADN polymérase. La température maximale de dénaturation après l'ajout de la Taq ADN polymérase ne doit pas dépasser 95°C.
2. Température de recuit de l'amorce La température de recuit détermine la spécificité et le rendement de la PCR ; si la température est élevée, la spécificité est forte, mais si la température est trop élevée, l'amorce ne peut pas être fermement combinée avec la matrice, et l'efficacité d'amplification de l'ADN est réduite ; la température est basse, le rendement est élevé, mais trop faible peut entraîner une inadéquation entre l'amorce et le modèle, les produits non spécifiques augmentent. Généralement, commencez par la condition de réaction de 37 , configurez une série de réactions de contrôle pour déterminer la température de recuit optimale pour une réaction spécifique. Elle peut également être déduite sur la base de la teneur en (G+C)% des amorces pour saisir le test Le point de départ du test général, la température de recuit Ta (température de recuit) est 5℃ inférieure à la température de fusion TTm (température de fusion) de l'amorce d'amplification, qui peut être calculée selon la formule :
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Parmi elles, A, T, G et C représentent respectivement le nombre de bases correspondantes. Par exemple, pour un primaire de 20 bases, si la teneur en (G+C)% est de 50%, le point de départ de Ta peut être fixé à 55°C. À une concentration d'amorce typique (telle que 0,2 μmol/L), la réaction de recuit peut être achevée en quelques secondes, et un recuit à long terme n'est pas nécessaire.
3. Le choix de la température d'extension d'amorce dépend de la température optimale de la Taq ADN polymérase. Généralement 70～75℃, le taux standard de nucléotides catalysés par une enzyme à 72℃ peut atteindre 35～100 nucléotides/sec. par minute. La longueur de 1 kb peut être étendue et sa vitesse dépend de la composition de la solution tampon, de la valeur du pH, de la concentration en sel et de la nature de la matrice d'ADN. Si le fragment amplifié est plus court que 150 pb, l'étape d'extension peut être omise, et cela devient un cycle à double température, à cause de l'ADN Taq. La polymérase est suffisante pour achever la synthèse de courtes séquences à la température d'annelage. Pour les fragments de séquences courtes entre 100 et 300 pb, il est efficace d'utiliser un cycle double température rapide et simple. A ce moment, la température d'extension de l'amorce est la même que la température de recuit. Pour les fragments d'ADN supérieurs à 1 kb, le temps d'extension peut être contrôlé en 1 à 7 minutes selon la longueur du fragment. Dans le même temps, de la gélatine ou du réactif BSA doit être ajouté au tampon PCR pour maintenir l'ADN polymérase Taq active et stable pendant une longue période. Sexe; 15 % à 20 % de glycérol aide à amplifier des fragments d'ADN d'environ 2,5 kb ou plus.
4. Le nombre de cycles de PCR classique est généralement de 25 à 40 cycles. L'erreur générale est que le nombre de cycles est trop important, le fond non spécifique est sérieux et la complexité augmente. Bien entendu, le nombre de cycles de la réaction est trop faible, et le rendement est faible. Par conséquent, il est nécessaire de s'assurer que le produit est obtenu. En vertu du principe du taux, le nombre de cycles doit être minimisé.
Une fois l'amplification terminée, l'échantillon est refroidi et stocké à 4°C.
2. Conception de l'apprêt
Pour amplifier l'ADN matrice, vous devez d'abord concevoir deux amorces oligonucléotidiques. Les soi-disant amorces sont en fait deux fragments d'oligonucléotides complémentaires de la séquence d'ADN cible à amplifier. La distance entre les deux amorces détermine la longueur du fragment amplifié. , Les 5'extrémités des deux amorces déterminent les positions des deux 5'extrémités du produit amplifié. On peut voir que les amorces sont la clé pour déterminer la longueur, la position et les résultats des fragments amplifiés par PCR, et la conception de l'amorce est plus importante.
La condition nécessaire pour la conception de l'amorce est que la séquence d'ADN cible complémentaire de l'amorce doit être connue. La séquence entre les deux amorces n'est pas nécessairement claire. Les deux séquences connues sont généralement de 15 à 20 bases, qui peuvent être synthétisées avec un synthétiseur d'ADN. Correspondant à deux amorces complémentaires, en outre, les principes généralement suivis dans la conception des amorces comprennent :
1. La longueur de l'amorce est calculée selon les statistiques, et la probabilité qu'une séquence oligonucléotidique d'environ 17 bases puisse apparaître dans le génome humain est de une fois. Par conséquent, la longueur de l'amorce n'est généralement pas inférieure à 16 nucléotides, et la plus élevée pas plus de 30 nucléotides, et la meilleure longueur est de 20 à 24 nucléotides. De tels oligonucléotides courts ne formeront pas un hybride stable à la température de polymérisation (passant à 72°C). Parfois, cela peut être à 5' Ajoutez des séquences qui ne sont pas complémentaires à la matrice à la fin, telles que des sites d'enzymes de restriction ou des promoteurs, pour compléter le clonage de gènes et d'autres besoins particuliers ; l'amorce 5'fin marqueur biotine ou marqueur fluorescent peut être utilisé à diverses fins telles que la détection microbienne.
Parfois, l'amorce ne fonctionne pas, la raison est inconnue, vous pouvez déplacer la position pour le résoudre.
2. La composition des amorces à teneur en (G+C)% doit être uniforme et essayer d'éviter de contenir le même polymère de base. La teneur en (G+C)% dans les deux amorces doit être aussi similaire que possible, dans le fragment amplifié connu (G+C) % Content doit être proche du fragment à amplifier, généralement 40% à 60% c'est mieux.
3. L'intérieur de l'apprêt doit éviter la formation de structures secondaires évidentes, en particulier des structures en épingle à cheveux. Par exemple:
4. Il ne doit pas y avoir de complémentation entre les deux amorces entre les amorces, en particulier à l'extrémité 3' de l'amorce. Même si cela ne peut être évité, la base complémentaire de 3'extrémité ne doit pas être supérieure à 2 bases, sinon il est facile de former un"primer dimer" Ou"Primer dimère" (Amorceur dimère). Le dimère dit d'amorce est essentiellement un fragment d'ADN double brin formé par extension d'une amorce sur l'autre séquence d'amorce sous l'action de l'ADN polymérase. , Est un sous-produit courant de la PCR et devient parfois même le produit principal.
De plus, évitez les séquences homologues entre les deux amorces, notamment les fragments d'oligonucléotides avec plus de 6 bases identiques consécutives, sinon les deux amorces entreront en compétition pour le même site de la matrice ; de même, les amorces et l'ADN cible à amplifier ou d'autres séquences de l'ADN échantillon ne peuvent pas avoir de séquences homologues de plus de 6 bases. Sinon, les amorces se lieront à d'autres sites, réduisant l'amplification spécifique et augmentant l'amplification non spécifique.
5. L'ADN polymérase d'appariement des extrémités de l'amorce 3' ajoute un seul nucléotide à l'extrémité 3' de l'amorce. Par conséquent, les exigences d'appariement de 5-6 bases de l'extrémité 3'de l'amorce et de l'ADN cible doivent être précises et strictes pour assurer une amplification PCR efficace. .
Le caractère raisonnable de la conception de l'amorce peut être vérifié par une recherche informatique à l'aide du logiciel PCRDESN et du logiciel américain PRIMER.
Les oligonucléotides synthétisés artificiellement doivent de préférence être purifiés par chromatographie (chromatographie) ou PAGE pour éliminer les impuretés telles que les chaînes courtes qui n'ont pas été synthétisées sur toute leur longueur. Les amorces purifiées conservées dans une solution d'acétonitrile à 25 % à 4 °C peuvent empêcher les micro-organismes Dans des circonstances normales, les amorces non utilisées doivent être conservées au réfrigérateur à -20 °C. Les amorces peuvent être conservées dans un liquide pendant 6 mois, et peuvent être conservées pendant 1 à 2 ans après lyophilisation.